海綾月兔兔認養專區

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國立中興大學獸醫學院獸醫學系臨床討論病例報告

<結報>

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兔病毒性出血症及梭狀桿菌感染症

(Rabbit Hemorrhagic Disease and Clostridiosis)

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姓名：林雅玲??????????????????????????? 學號：48638022

掛號日期：90.7.27??????????????????? 病理號碼：CM01-0713

報告日期：90.11.22?????????????????? 病歷號碼：90-2221

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摘要

中部某兔養殖場，於民國90年7月底發現其場內3個月齡成兔有虛弱，吐血症狀不久即死亡；而1個月齡幼兔呈瘦弱且有下痢症狀，整場死亡率約為6 %。遂將4隻死亡成兔，2隻死亡幼兔及若干糞材送至本教學醫院進行檢驗。成兔外觀可見鼻出血；肉眼病變可見肺、肝、脾、腎等實質器官的出血、腫大；組織病變可見肝、肺、脾間質充出血，肝的多發壞死灶，及肺微血管、腎絲球動脈血栓；實驗室檢查經RT-PCR檢測兔病毒性出血症為陽性。幼兔外觀為消瘦，下痢；肉眼病變可見盲腸壁變薄，腸腔內充滿氣體及水樣內容物；組織病變可見盲腸、結腸絨毛壞死脫落；微生物學分離鑑定出梭狀桿菌(Clostridium spp.)。最終診斷成兔為兔病毒性出血症，幼兔為梭狀桿菌感染症。

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病史

中部某自家生產之兔繁殖場，飼養隻數5000隻，品種為Oryctolagus cuniculus，據畜主表示於90年7月底發現3個月齡成兔有虛弱，吐血症狀而隨之死亡；而1個月齡幼兔則有瘦弱，下痢等症狀。整場發病率為20 %，死亡率為6 %。遂於90年7月27日送來已死亡成兔4隻，已死亡幼兔2隻及若干糞材至家畜醫院進行檢驗。

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肉眼病變

CM01-0713A (幼兔)

外觀：消瘦，肛門附近皮毛沾有下痢便。

盲腸：壁變薄，腸腔內充滿氣體及含水樣內容物。(圖七)

結腸：黏膜多處可見局部出血灶。

CM01-0713B (成兔)

外觀：鼻吻部沾有血液(圖一)，兩耳發紺，眼眶周圍水腫。

肺臟：兩側肺臟瀰漫性充血，觸感堅實。(圖二)

肝臟：瀰漫性充血。

脾臟：腫大，充血。

胃：胃大彎處黏膜面大區域出血。

結腸：漿膜面多處出血斑。

CM01-0713C (成兔)

與B相似，另有

腎臟：雙側腎臟出血，腫大。(圖三)

輸卵管：漿膜面局部出血。

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初步診斷

疑似兔之病毒性出血症及梭狀桿菌感染之腸炎

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組織病理學檢查

CM01-0713 A (幼兔)

肺：間質有巨細胞及淋巴球浸潤；肺泡上皮細胞增生；部分血管旁有淋巴球聚集。

小腸、盲腸：大部分絨毛壞死脫落。(圖八)

結腸：大部分絨毛壞死脫落；黏膜下層大量淋巴球浸潤。

CM01-0713B (成兔)

大腦：腦膜下出血。

小腦：輕微脫髓鞘現象。

肝：部分門脈三角區旁有輕微肝細胞壞死。

肺：間質出血；血管旁單核細胞聚集；血管內血栓形成。(圖五)

脾：間質大區域壞死；血鐵素沈著。

腎：絲球體小動脈血栓，腎小管間微血管鬱血。(圖四)

胃：黏膜下層炎症細胞聚集。

腸：絨毛壞死脫落；黏膜固有層出血，有淋巴球聚集。

氣管：黏膜下層靜脈鬱血；血管周圍出現單核炎症細胞。

CM01-0713C (成兔)

肺：肺泡腔有水腫液；肺泡壁微血管鬱血；動靜脈血管內有血栓形成。(圖五)

肝：肝細胞死後變化；門脈三角區內靜脈血栓。

腎：絲球體小動脈血栓形成，腎小管間微血管鬱血。(圖四)

腸：絨毛壞死脫落；腺窩細胞壞死；黏膜下層淋巴球聚集。

氣管：黏膜下層靜脈鬱血；血管周圍炎症細胞聚集。

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微生物學檢查及藥物敏感性試驗

(一)微生物學檢查

1.於成兔肺臟、肝臟及脾臟以無菌方式進行釣菌，以MacConkey agar及血液培養基在37℃進行培養，24小時後發現菌落生長，經GFB-12E電腦密碼細菌鑑定系統鑑定為Citrobacter amalonaticus(鑑定率為55.6 %)。

2.先以幼兔之盲腸及小腸黏膜作抹片，經革蘭氏染色後鏡檢，可見大量陽性大型桿菌；再於相同器官以無菌方式進行釣菌，以MacConkey agar及血液培養基在37℃進行培養，24小時後菌落生長，經GFB-12E電腦密碼細菌鑑定系統鑑定為Citrobacter amalonaticus(鑑定率55.6%)及Escherichia coli(鑑定率86.8%)；另一方面以血液培養基在37℃，厭氧情況(二氧化碳約佔20%)下進行培養，48小時後可見菌落生長，經鑑定為Clostridium spp.。

(二)藥物敏感性試驗

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實驗室診斷

採集成兔檢體包括肝、肺、脾、腎、腸等臟器，磨成乳劑，高速離心後取上清液進行病毒核酸之萃取，接著以萃取出的病毒核酸進行反轉錄聚合?鏈鎖反應(RT-PCR)。反應結束後以電泳分析進行確認，確定病材呈兔病毒性出血症(Rabbit hemorrhagic disease；RHD)陽性反應。(圖六)

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寄生蟲檢查

1.利用畜主提供之幼兔若干糞材進行檢查

a.浮游法

取若干糞便與飽和食鹽水混合均勻於試管中，食鹽水加滿至管口形成表面張力，靜置5～30分鐘，以載玻片沾取管口表面液體後覆上蓋玻片，鏡檢之。結果可發現已芽胞化之球蟲卵囊，進一步檢查其型態(有無卵囊內殘留體及stieda body、卵囊的大小等)，鑑定為腸型球蟲(Eimeria intestinalis)。

b.卵囊數量計算

因糞量不足，遂取0.1克糞便與10毫升飽和食鹽水攪拌混合，待30分鐘後以滴管吸取表面糞液於載玻片上鏡檢計數全部卵囊數，求出每克糞便中有球蟲卵囊約2260個。

2.腸內容物檢查

滴一滴盲腸內水樣內容物於玻片上，重複多次鏡檢並無發現球蟲卵囊。

3.組織病理學檢查

腸的組織切片下未見蟲體。

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最終診斷

兔病毒性出血症及梭狀桿菌感染症

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建議處置

成兔

1.病兔與健康兔隔離，但最好以統進統出方式，將病兔及殘存的兔隻移除。病死兔經消毒後深埋或焚燒處理。

2.污染場地、籠舍及器具應用2%鹼水或3%福馬林溶液進行消毒處理，清場2個月以上才可進新兔飼養。

3.利用高床飼養，注意環境清潔，以減少兔隻與糞便等污染源接觸。

4.由RHD-free之兔場引進新兔，同時落實疫苗之接種，30～60日齡首次免疫，3個月後再次免疫，之後每隔半年免疫一次。

幼兔

1.使用廣效性抗陽性菌抗生素，如tetracycline, bacitracin, penicillins等。

2.投予抗球蟲藥(如:Sulfaquinoxaline)以作為預防。

3.加強環境之清潔與消毒，同時減少環境造成的緊迫。

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疫情追蹤

疫情爆發約一個月後電訪畜主，其已將成兔全部撲殺淘汰，而幼兔則使用枯草菌素250～300 ppm及球蟲藥預防治療，病情已有所控制。

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討論

本病例由於成兔與幼兔感染疾病之不同，因此分開討論。

兔病毒性出血症(rabbit hemorrhagic disease；RHD)為一高度傳染性，高致死性疾病，最早發生於1984年中國大陸，接著中歐、墨西哥、北非、英國、澳洲相繼爆發，台灣在1994年首次發生[1]。兔病毒性出血症病毒(rabbit hemorrhagic disase virus；RHDV)屬於Caliciviridae中Calicivirus，在歐洲有一疾病，European brown hare syndrome，病原雖與RHDV同屬，但不同種，會造成兔隻急性死亡，症狀與 RHD相似，但不造成家兔之感染。家兔為RHDV最主要自然宿主，自然條件下只感染2月齡以上，體重2公斤以上之成兔[7]，仔兔自然感染或即使大劑量人工感染亦不呈現臨床症狀，少數在病理變化可見肝細胞壞死及炎症細胞聚集，且變性肝細胞及巨噬細胞中可發現RHDV抗原[11]。為何只有成兔發病之道理尚未了解，但有報告指出引進常接觸RHD的幼兔，原本的場內兔隻在移行抗體消失後會有爆發情形[5,6]。

本病之傳播為經口食入帶病原的分泌物、尿液或糞便而感染，空氣傳播[1]及昆蟲(flies)的機械性傳播也有可能[3]。兔糞便中含有尚未消化的蛋白質、維生素，因此兔子食糞為一正常生理現象，有利食物進一步消化與吸收，但這種行為卻造成此疾病的快速傳播。在本場中大爆發原因可能為引進帶有病原的新兔，未加以隔離飼養，或經由人及其他動物將病原帶入，加上本場未施行疫苗計劃所致。

臨床表現分三型：於甚急型，一般猝死而無症狀，可能會流鼻血；急型則出現發燒、食慾不振、感覺遲鈍等非特異性症狀，常伴隨神經症狀後迅速死亡，少數耐過而出現黃疸。亞急型非特異性症狀輕微，不易觀察，可耐過且持續帶毒及排毒[10]。所以為杜絕本病在場中再發生，最好全部撲殺處理，清場消毒至少2個月後由RHD-free場引進兔隻。病理變化在肉眼下為各組織臟器如肝、肺、脾、腎、胸腺等不等程度的點狀出血，實質鬱血，水腫和變性；典型組織病變可見肝細胞多發變性壞死之肝炎，血管內皮細胞、管內單核細胞自殺現象(apoptosis)及血管內血栓[2]。有報告指出肝細胞自殺現象與RHDV感染呈相關性[8]。而肝臟之急性變性造成凝血因子問題及循環不良，致使肺、氣管、腎血管鬱血，凝血(disseminated intravascular coagulation；DIC)，偶見出血[10]。本病例中肝臟的病變不明顯，可能因為尚未形成病變，兔隻就死亡。本病例之診斷由病史，臨床症狀，病理學變化，加上多處臟器萃取出病毒之RT-PCR結果為RHD呈陽性反應，因此可確診。實驗室診斷除了RT-PCR外，尚可用掃描式電子顯微鏡(SEM)直接觀察到病毒在肝臟的存在；製作冷凍切片進行螢光抗體染色以確定組織中抗原的存在；直接用人類O型紅血球進行血球凝集試驗(haemagglutination test；HAT)等，皆可作為確診之證據。在波蘭發現一變異株，其HAT結果為陰性[9]。在防治方面，被動高免血清可提供於有臨床症狀的兔子的治療處理，但保護期短，就整場經濟效益來說可能不適用；而不活化疫苗的大規模使用能有效預防本病的發生，可保護家兔6個月以上且接種後5～6天產生抗體[2]，可惜在台灣無商品化產品，兔場間疫苗的使用並不普遍。就本場而言，成兔的全面撲殺及清場確實能杜絕病原，但也要同時保護幼兔，雖然不發病，影響其生理狀況造成內在性緊迫也不無可能，因此除加強隔離外，更要例行疫苗接種才能避免此並再次發生。公共衛生方面，RHDV不造成人類的感染[4]。

區別診斷：年輕兔隻急性巴斯德桿菌感染可能造成流行性肺炎或敗血症而死亡，病理變化可見支氣管性肺炎、因敗血造成之臟器充出血或肝臟明顯壞死灶，於心、肝、脾臟中可分離，且病理組織切片經染色可見兩極著色的小桿菌；而RHD無支氣管性肺炎，且細菌培養為陰性。

於幼兔方面，造成幼兔之腸炎病原很多，有Clostridium species(Clostridium perfringen type E、C. sporiforme)，Escherichia coli，Rotavirus，球蟲等。Clostridium species可能以良性狀態或低數量存在於兔之大腸中，經種種原因而大量增殖，變成感染原。其致病原因為分泌的毒素，造成腸黏膜及血管通透性增加，血管擴張，因而造成下痢、腸炎及毒血症。E. coli雖然不為兔腸道內正常存在細菌，但可能於盲腸內大量發現其存在，其首先附著於peyer’s patch上皮，之後於小腸、盲腸、結腸之腸細胞，造成黏膜通透性增加，兔隻因而下痢。不同種類的球蟲(Eimeria)雖然為兔腸內常見原蟲，但可伺機破壞黏膜上皮，造成腸炎。本病例的微生物學檢查檢驗出Clostridium spp.及E. coli，在畜主送來的幼兔糞便中檢驗出已芽胞化球蟲卵囊，但於解剖兔之腸內容物及腸組織切片則未檢出，可能原因為1.畜主送來的糞材並不是剖檢幼兔的糞便。2.集取糞材過程有球蟲卵囊污染。3.幼兔腸道內確實有球蟲感染，尚未造成病變，因檢驗疏失未觀察到或切片未切到。學生認為前兩者較有可能，因此於診斷上球蟲感染不列入考慮。但就整場考量而言，還是要投予球蟲藥，以預防球蟲感染的爆發。

梭狀桿菌造成的腸炎，會進一步形成毒血症，為致死原因[12]。兔之毒血症首次於1936年報告，鑑定C. perfringen type E的iota toxin為造成原因。其傳播雖然可能經口時入糞便而感染，但通常為本身腸內菌量的增殖造成，前致因子可能有：1.)多發於4～8週齡兔，此時體生長快速，移行抗體漸消失，且腸內微生物大量增殖。2.)飼料品質改變。a.餵飼低蛋白質飼料時，peyer’s patches的數目會減少。b.澱粉含量高或顆粒過大的飼料皆可能造成未消化的澱粉通過小腸，使盲、結腸形成適合病原生長的環境。C. sporiforme的毒素的合成需葡萄糖，因此有食過量碳水化合物而引起腸炎的理論。c.飼料中纖維含量少。低纖維性食物使盲、結腸蠕動減少，造成管腔擴張且盲腸內容物不正常發酵，改變酸鹼值、濃度等，使正常菌相改變。另一間接原因為高纖維食物減少了可用的碳水化合物。3.)抗生素之使用。lincomycin，penicillin，ampicillin，erythromycin，clindamycin等的使用可能打亂腸內菌叢生態，使Clostridium species大量增殖而引起腸炎。4.)環境造成的緊迫。如突然的溫度改變，飼養環境及飼料改變等，造成兔隻緊迫而減少腸蠕動。增加Vitamine C的攝取可減少緊迫對兔隻造成的影響，也可抑制C. sporiforme形成毒素。5.)營養不良(anorexia)或抵抗力下降。

診斷梭狀桿菌感染造成的腸炎要依照症狀及病變，雖然檢出毒素的存在才是主要，但證實毒素的存在是困難且昂貴的，因此刮取盲腸壁染色鏡檢，見革蘭氏陽性之大桿菌或螺旋捲曲的菌體，可幫助診斷[10]。本病例因肉眼病變下小腸有出血病灶，盲腸壁變薄、腔內充氣，腸黏膜抹片可見大量陽性大型桿菌，加上投藥後疫情有明顯改善，因此可確診。在組織病理學方面，腸道之死後變化快速，可能無法做正確診斷，但切片下死後變化雖然可見絨毛上皮細胞的壞死脫落，卻不見炎症細胞浸潤，可加以區別。正常狀況下，兔子死亡後腸道內梭狀桿菌也會大量增殖，可能造成抹片證據的誤解，但死後並不引起絨毛萎縮、壞死融合，出血及炎症細胞的浸潤，可藉此區分。本病例在肺組織中可見巨大細胞，因為慢性病程，排除因毒血症的毒素跑至肺臟的因素，推測為病兔腸炎發病後會虛弱，精神不繼而俯臥在地時，吸入灰塵或病原所造成。又此肺臟病變區域在肉眼下只佔全部肺臟的5 %，因此此處病變不納入診斷的重點。

病兔的治療除投予廣效性抗生素外，支持療法如充足水分及離子的給予等可施行。預防方面則注意飼料成分及品質，給予充分的營養，減少環境的緊迫。腸炎演變為腸毒血症通常僅散發，不造成困擾。

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參考文獻

1.????? 劉振軒,邱慧英,張文發,林滄龍。兔病毒性出血症。引自:乙類動物傳染病之簡介。台灣養

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3.????? Asgari S, Hardy JR, Sinclair RG, Cooke BD. Field evidence for mechanical transmission of rabbit haemorrhagic disease virus (RHDV) by flies (Diptera: Calliphoridae) among wild rabbits in Australia. Virus Res 54: 123-32, 1998.

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10.? Lieve Okerman. Systematic disease. In: Disease of Domestic Rabbits, 2nd, 100-111, 1994.

11.? Mikami O, Park JH, Kimura T, Ochiai K, Itakura C. Hepatic lesions in young rabbits experimentally infected with rabbit haemorrhagic disease virus. Res Vet Sci 66: 237-42, 1999.

12.? Patton NM, Holmes HT, Riggs RJ, Cheeke PR. Enterotoxemia in rabbits. Lab Anim Sci 28: 536-40, 1978.

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問題與討論

1.本病例中其藥物敏感試驗的結果與建議給藥不同？且為何建議使用枯草菌素？

答：本次只有作E. coli和Citrobacter的藥物敏感性試驗，因為其為環境及腸道中常在菌，加上腸道抹片中陰性菌的數量遠小於陽性梭菌數量，故不認為兩者為致病原而不建議給藥。而梭狀桿菌的藥物敏感試驗方法與一般藥片方法不同，其成本相對較高，在沒做的情況下只好建議使用廣效性抗陽性菌抗生素，如四環素、枯草菌素。枯草菌素在地方上使用於治療梭狀桿菌感染較為有效，因此建議使用。

2.為何幼兔糞便中發現球蟲，題目卻未列上？且不將E. coli和Citrobacter考慮為致病原？

答：本病例中雖然於畜主帶來的幼兔糞便中發現球蟲卵囊，但於剖檢的兩隻幼兔腸道抹片及組織病理切片鏡檢下未發現球蟲卵囊或蟲體，因此就帶來剖檢的幼兔來說，確實沒有球蟲的感染。但推測畜主帶來的糞便污染到場中其它兔隻有球蟲的糞便，其整場確實有球蟲感染的可能，因此建議給予球蟲藥以治療及預防。

3. Clostridium為腸道常在菌，為何認為是致病原？

答：Clostridium在兔子腸道中一般不存在或數量很少，而在本病例中取小腸出血段黏膜抹片可見大量的陽性大型桿菌；肉眼病變下小腸有出血病變，盲腸壁變薄、腔內充滿氣體；組織病變下絨毛的壞死融合、炎症細胞浸潤，因此認為其腸內菌叢改變使梭狀桿菌大量增殖而形成致病原。另外整場幼兔在投予枯草菌素後其下痢疫情有明顯改善，可確診為梭狀桿菌感染症。

4.如何用動物試驗檢驗Clostridium毒素存在？

答：a.將腸道內容萃取物0.4 ml靜脈注射於小白鼠，若10小時內死亡，表示有毒素存在。

b.將腸道內容萃取物打入兔隻兩邊都結紮的腸道中，觀察此段腸道是否有梭狀桿菌感染的病變，可證明毒素的存在。

c.中和試驗：利用4隻黃金鼠作試驗。先打antitoxins於２隻皮下(對照組)，再全部打入毒素。若結果實驗組10-12小時死亡而對照組存活，表有毒素存在；兩組皆存活，表沒有毒素存在；兩組皆死亡，表示有其他毒素。

5. Clostridium感染症的病程？

答：甚急性—小腸充出血，腸絨毛受損，並有大型桿菌附著。

急性—有紅棕色水樣下痢便，病變為小腸潮紅、腸壁灰白色、有紅色血樣內容物。

亞急性—持續性非出血性下痢。下痢便早期為黃色，後來轉為澄清液狀並含壞死組織塊，病變為小腸黏膜黃色膜且變厚。

慢性—斷續或持續的下痢，腸黏膜表面無明顯病變，偶有局部增厚或局部壞死斑或炎症層。

6. 兔子的糞便分幾種？

答：兩種。在白天排出結實的，形狀完整的糞丸。夜間所排的糞丸特別小，味道難聞，有淡綠色的光澤並覆蓋有黏液，看上去像一串串葡萄，這些較軟的糞便成分跟盲腸包含物成分相似，含有蛋白質、非蛋白質、粗纖維、維生素B群及大多數食物中的礦物質。所以兔子的食糞現象多在清晨幾小時中發生，僅吃晚間排出較軟的糞便。

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